تويت
رحلان كهربايي
Electrophoresis - Electrophorèse
الرَّحَلان الكهربائي
المبدأ العام
تستخدم طرائق الرحلان الكهربائي electrophoresis لفصل المركَّبات بحسب نسب شحنتها إلى كتلتها وذلك بتأثير الحقل الكهربائي في شحنة هذه المركبات، مما يؤدي لاختلاف سرعة انتقال الأيونات أو المركبات القابلة للتأين التي يعطيها محلولها الكهرليتي، حيث تتجه الأيونات نحو المصعد (الأنود) والكاتيونات نحو المهبط (الكاتود) وتتآثر كروماتوغرافياً مع الداعم.
تشبه هذه الطريقة الكروماتوغرافيا الورقية أو الاستشراب على الورق paper chromatography إذ يستخدم لهذا الغرض ورقة كروماتوغرافية بمثابة داعم تحمل عليها العينات المراد فصلها، وبوجود محلول موقٍ يقوم بدور طور متحرك.
الوصف
يوضح الشكل (1) وصفاً مبسطاً لهذه الطريقة.
تثبت الورقة الكروماتوغرافية بحيث توصل إحدى نهايتيها بحجرة الكاتود والنهاية الأخرى بحجرة الأنود. تحمل العينات على نقاط محددة مسبقاً وتملأ حجرتا الأنود والكاتود بالمحلول الموقي الذي يصعد في الورقة بفضل الخاصة الشعرية[ر]. يوصل المسريان بمنبع للتيار المستمر DC وتراقب عملية الرحلان. يلعب المحلول الموقي دور الناقل الكهربائي، بينما تقوم الورقة الكروماتوغرافية بدور الجسر الذي يصل بين حجرتي الأنود والكاتود. ويتم فصل المركبات بفضل تفاوت سرعة الجسيم أو الأيون في الحقل الكهربائي المطبَّق.
تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع مع الجسيمات الغروية المشحونة وأيونات الجزيئات المكروية، مثل البروتينات والحموض النووية وعديدات السكاريد polysaccharides.
تسلك المركبات في طريقة الرحلان الكهربائي سلوكاً مختلفاً بحسب طبيعة الرابطة السائدة فيها مثل:
ـ الرابطة الأيونية: كما في الحموض والأسس والأملاح اللاعضوية التي توجد بشكل متأين، NaCl مثلاً، وحمض الخل (CH3COO)- H+ ومتيل هيدروكسيد الأمونيوم (CH3NH3)+OH- وأسيتات البيريدين
ـ الرابطة التكافؤية: لا تظهر المركبات ذات الرابطة التكافؤية أي نشاط في الرحلان الكهربائي لأنها لا تتأين، كما في مركّب رباعي كلوريد الكربون CCl4، وتبقى هذه الطريقة حصراً على المركبات القابلة للتأين.
العوامل المؤثرة في عملية الفصل
1- حجم الأيون ومقدار الشحنة: وهما عاملان متعاكسان فكلما ازداد حجم الأيون كان رحيله أبطأ، وكلما ازداد مقدار الشحنة ازدادت المسافة التي تقطعها، مما يشكل قوتين متعاكستين، ولا يختلف الفعل الناجم عنهما من مركّب لآخر.
2- فرق الكمون المطبق والتأثير الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة: تعتمد هجرة كل مادة على فرق الكمون أو الحقل الكهربائي المطبق. ويعبر عن شدة الحقل الكهربائي بالفولط لكل سنتمتر الذي يراوح بين 500 فولط لكل سنتمتر وعدة آلاف من الفولطات لكل سنتمتر. ويستخدم الأخير للفصل العالي السرعة لمواد ذات وزن جزيئي منخفض. أما الجزيئات المكروية التي تتصف بحركية أيونية أقلّ فهي أصعب انقياداً لعمليات الفصل بفرق الكمون المرتفع. تؤدي الحرارة المتولدة إلى تبخر جزء من المحلول الموقي الذي يكون بطيئاً في فروق الكمون المنخفضة ويزداد بازديادها ويمكن أن يصل إلى حد الجفاف. كما يؤدي التبخر إلى ازدياد تركيز المحلول الموقي في الورقة مؤدياً بدوره إلى إضعاف مقاومة الورقة الكروماتوغرافية. لذا يعد التبخر من المشاكل الأولى التي تعترض هذه الطريقة وللحصول على فصل جيد في فترة زمنية مقبولة دون ارتفاع كبير في درجة الحرارة، يؤخذ بالحسبان كل من العوامل الآتية: المقاومة - فرق الكمون – التيار- تركيز المحلول الموقي.
3- درجة حموضة المحلول الموقي: يلعب هذا العامل دوراً كبيراً في جودة فصل المركبات وخاصة المذبذبة amphoteric منها (أي التي تلعب دور الحموض والأسس). وتبين المعادلات تأثير درجة حموضة الوسط على فصل الحموض الأمينية:
يدعى الشكل B بالأمفوليت، وهو الشكل المسيطر في قيمة الـ pH الموافقة لنقطة التعادل الكهربائي للحمض الأميني. وتعرف نقطة التعادل الكهربائي isoelectric point بأنها الـ pH الذي تكون فيه الشحنة المحصلة على الجزيء مساوية الصفر فلا يبدي أي حراك رحلاني. أما في المحاليـل الأكثـر حموضة فتأخذ CO2 - بروتوناً لتشكل كاتيوناً (الشكل A) ويتجه الأيون عندها نحو الكاتود، بينما في المحاليل الأكثر قلوية تفقد الزمرة
- بروتوناً لتشكل أنيوناً (الشكل C) ويتجه الأيون في الحالة هذه نحو الأنود. وهكذا تتغير نقطة التعادل الكهربائي من حمض أميني إلى آخر وفقاً للحموضة والقلوية النسبية للزمر الكربوكسيلية وزمر الأمينو. وبهذه الطريقة يمكن إنجاز عمليات الفصل الزمروية المعتمدة على نقاط التعادل الكهربائية عن طريق التحكم في الـ pH.
4- الفعل الأسموزي الكهربائي
5- فعل الانتشار diffusion الناجم عن حركة بعض المركّبات تحت تأثير المحلول الموقي قبل تطبيق التيار الكهربائي .
6- سرعة الرحلان وتقدر بـالسنتمتر/ثا لدى تطبيق حقل كهربائي شدته 1 فولط/سم.
7- الطاقة المطبقة.
أنواع الرحلان الكهربائي
1- الرحلان الكهربائي النطاقي zone electrophoresis: ويعد من أكثر طرائق الرحلان شيوعاً. يدعم البروتين على سبيل المثال هنا على جسم صلب، فتدخل إضافة إلى قوى الهجرة الكهربائية قوى الكروماتوغرافيا التقليدية في كفاءة الفصل. وهناك عدة أنواع من الرحلان الكهربائي النطاقي بحسب الأنواع المختلفة من الدواعم المستعملة، وتتضمن هلامات النشاء وهلامات بولي الأكريل أميد ورغوة البولي يوريتان والورق.
وتعد تقنية الرحلان الكهربائي على هلامات النشاء من التقنيات المألوفة على الرغم من الاستعاضة عنها في الوقت الحاضر بهلامات بولي الأكريل أميد، التي تخفض من تأثيرات الانتشار والحمل إلى حدودها الدنيا. تحضَّر صفيحة أو كتلة من هلامة النشاء، ثم تطبق العينة على شكل شريط ضيق بعرض الصفيحة حوالي منتصف المسافة بين طرفيها اللذين يوصلان بمسريين في جسر الوصل. وعندما يمر التيار عبر الخلية تتحرك مكونات المزيج المختلفة بسرعات تتوقف على شحنتها الكهربائية وحجومها وأشكالها. وبتقدُّم الرحلان تهاجر المكوِّنات المشحونة سلباً نحو الأنود والمشحونة إيجاباً نحو الكاتود، ونحصل بالنتيجة على سلسلة من العصابات المفصولة أو على خطوط من مكوّنات العينة التي يمكن إظهارها بملوِّن.
2- الرحلان الكهربائي الشعري النطاق Capillary zone electrophoresis (CZE): تمكّن هذه الطريقة من فصل كميات صغيرة جداً من المواد خلال زمن قصير نسبياً وبتفريق مرتفع، فهي توفر إمكانية تحليل حجم من العينة لا يتجاوز النانوليتر (10-9 ليتر)، كما توفر حساسية كشف للمكونات المحقونة تصل إلى سوية الأتومول ( 10-18مول).
يوضح الشكل (2) جهاز الرحلان الكهربائي الشعري النطاق. يأخذ وسط الفصل شكل أنبوب شعري من السيليكا المصهورة (بقطر داخلي من 10 إلى 100 ميكرو متر وطول 1م ) يحوي كهرليتاً مناسباً. وبعد أن يدخل حجم صغير من العينة في إحدى نهايتيه، يوضع طرفا الأنبوب الشعري في محلول كهرليتي موق (هو عادة المحلول نفسه الموجود في الأنبوب الشعري). يوصل المسريان بعد غمسهما في المحلول بمنبع تيار مستمر قادر على تمرير تيار يصل حتى 250 ميكرو أمبير، ويؤمن فروق كمون تراوح بين 1000 و30000 فولط. يتدفق المحلول عبر مكشاف فوق بنفسجي UV امتصاصي يوضع على إحدى نهايتي الأنبوب الشعري أو قريباً منها تهاجر الجزيئات المعتدلة معاً بالتناضح العكسي. فإذا ضمن الطور المتحرك منظفات تشكل مُذْيَلات micelle، فإن الجزيئات تتآثر بصورة متفاوتة مع هذه المُذْيَلات، فتفتقر عن بعضها بعضاً، كما تمنع امتزاز البروتينات مثلاً على الجدران. تدعى هذه التقنية عندئذ الكروماتوغرافيا الشعرية الإلكتروحركية المذيلة (MECC) micellar electrokinetic capillary chromatography.
تطبيقات الرحلان الكهربائي
تستخدم تقانة الرحلان الكهربائي على نطاق واسع في الطب. فمثلاً يظهر فصل بروتينات المصورة بالرحلان الكهربائي على هلامة النشاء وجود 18 مركباً. ويمكن استخدام مقياس الكثافة لقياس شدة النطاقات الملونة والحصول بذلك على معلومات كمية.
يمثل الشكل (3) تحليل مكونات المصل (ألبومين albumine وغلوبولين globuline)، في حين يمثل الشكل (4) استخدام تقنية الرحلان الكهربائي في التحاليل الأنزيمية التي تلعب دوراً مهماً في التشخيص المرضي.
فرانسوا قره بيت
Electrophoresis - Electrophorèse
الرَّحَلان الكهربائي
المبدأ العام
تستخدم طرائق الرحلان الكهربائي electrophoresis لفصل المركَّبات بحسب نسب شحنتها إلى كتلتها وذلك بتأثير الحقل الكهربائي في شحنة هذه المركبات، مما يؤدي لاختلاف سرعة انتقال الأيونات أو المركبات القابلة للتأين التي يعطيها محلولها الكهرليتي، حيث تتجه الأيونات نحو المصعد (الأنود) والكاتيونات نحو المهبط (الكاتود) وتتآثر كروماتوغرافياً مع الداعم.
تشبه هذه الطريقة الكروماتوغرافيا الورقية أو الاستشراب على الورق paper chromatography إذ يستخدم لهذا الغرض ورقة كروماتوغرافية بمثابة داعم تحمل عليها العينات المراد فصلها، وبوجود محلول موقٍ يقوم بدور طور متحرك.
الوصف
 |
|
| الشكل (1) مبدأ الرحلان الكهربائي |
تثبت الورقة الكروماتوغرافية بحيث توصل إحدى نهايتيها بحجرة الكاتود والنهاية الأخرى بحجرة الأنود. تحمل العينات على نقاط محددة مسبقاً وتملأ حجرتا الأنود والكاتود بالمحلول الموقي الذي يصعد في الورقة بفضل الخاصة الشعرية[ر]. يوصل المسريان بمنبع للتيار المستمر DC وتراقب عملية الرحلان. يلعب المحلول الموقي دور الناقل الكهربائي، بينما تقوم الورقة الكروماتوغرافية بدور الجسر الذي يصل بين حجرتي الأنود والكاتود. ويتم فصل المركبات بفضل تفاوت سرعة الجسيم أو الأيون في الحقل الكهربائي المطبَّق.
تستخدم هذه التقنية على نطاق واسع مع الجسيمات الغروية المشحونة وأيونات الجزيئات المكروية، مثل البروتينات والحموض النووية وعديدات السكاريد polysaccharides.
تسلك المركبات في طريقة الرحلان الكهربائي سلوكاً مختلفاً بحسب طبيعة الرابطة السائدة فيها مثل:
ـ الرابطة الأيونية: كما في الحموض والأسس والأملاح اللاعضوية التي توجد بشكل متأين، NaCl مثلاً، وحمض الخل (CH3COO)- H+ ومتيل هيدروكسيد الأمونيوم (CH3NH3)+OH- وأسيتات البيريدين
ـ الرابطة التكافؤية: لا تظهر المركبات ذات الرابطة التكافؤية أي نشاط في الرحلان الكهربائي لأنها لا تتأين، كما في مركّب رباعي كلوريد الكربون CCl4، وتبقى هذه الطريقة حصراً على المركبات القابلة للتأين.
العوامل المؤثرة في عملية الفصل
1- حجم الأيون ومقدار الشحنة: وهما عاملان متعاكسان فكلما ازداد حجم الأيون كان رحيله أبطأ، وكلما ازداد مقدار الشحنة ازدادت المسافة التي تقطعها، مما يشكل قوتين متعاكستين، ولا يختلف الفعل الناجم عنهما من مركّب لآخر.
2- فرق الكمون المطبق والتأثير الناجم عن ارتفاع درجة الحرارة: تعتمد هجرة كل مادة على فرق الكمون أو الحقل الكهربائي المطبق. ويعبر عن شدة الحقل الكهربائي بالفولط لكل سنتمتر الذي يراوح بين 500 فولط لكل سنتمتر وعدة آلاف من الفولطات لكل سنتمتر. ويستخدم الأخير للفصل العالي السرعة لمواد ذات وزن جزيئي منخفض. أما الجزيئات المكروية التي تتصف بحركية أيونية أقلّ فهي أصعب انقياداً لعمليات الفصل بفرق الكمون المرتفع. تؤدي الحرارة المتولدة إلى تبخر جزء من المحلول الموقي الذي يكون بطيئاً في فروق الكمون المنخفضة ويزداد بازديادها ويمكن أن يصل إلى حد الجفاف. كما يؤدي التبخر إلى ازدياد تركيز المحلول الموقي في الورقة مؤدياً بدوره إلى إضعاف مقاومة الورقة الكروماتوغرافية. لذا يعد التبخر من المشاكل الأولى التي تعترض هذه الطريقة وللحصول على فصل جيد في فترة زمنية مقبولة دون ارتفاع كبير في درجة الحرارة، يؤخذ بالحسبان كل من العوامل الآتية: المقاومة - فرق الكمون – التيار- تركيز المحلول الموقي.
3- درجة حموضة المحلول الموقي: يلعب هذا العامل دوراً كبيراً في جودة فصل المركبات وخاصة المذبذبة amphoteric منها (أي التي تلعب دور الحموض والأسس). وتبين المعادلات تأثير درجة حموضة الوسط على فصل الحموض الأمينية:
يدعى الشكل B بالأمفوليت، وهو الشكل المسيطر في قيمة الـ pH الموافقة لنقطة التعادل الكهربائي للحمض الأميني. وتعرف نقطة التعادل الكهربائي isoelectric point بأنها الـ pH الذي تكون فيه الشحنة المحصلة على الجزيء مساوية الصفر فلا يبدي أي حراك رحلاني. أما في المحاليـل الأكثـر حموضة فتأخذ CO2 - بروتوناً لتشكل كاتيوناً (الشكل A) ويتجه الأيون عندها نحو الكاتود، بينما في المحاليل الأكثر قلوية تفقد الزمرة
- بروتوناً لتشكل أنيوناً (الشكل C) ويتجه الأيون في الحالة هذه نحو الأنود. وهكذا تتغير نقطة التعادل الكهربائي من حمض أميني إلى آخر وفقاً للحموضة والقلوية النسبية للزمر الكربوكسيلية وزمر الأمينو. وبهذه الطريقة يمكن إنجاز عمليات الفصل الزمروية المعتمدة على نقاط التعادل الكهربائية عن طريق التحكم في الـ pH.4- الفعل الأسموزي الكهربائي
5- فعل الانتشار diffusion الناجم عن حركة بعض المركّبات تحت تأثير المحلول الموقي قبل تطبيق التيار الكهربائي .
6- سرعة الرحلان وتقدر بـالسنتمتر/ثا لدى تطبيق حقل كهربائي شدته 1 فولط/سم.
7- الطاقة المطبقة.
أنواع الرحلان الكهربائي
1- الرحلان الكهربائي النطاقي zone electrophoresis: ويعد من أكثر طرائق الرحلان شيوعاً. يدعم البروتين على سبيل المثال هنا على جسم صلب، فتدخل إضافة إلى قوى الهجرة الكهربائية قوى الكروماتوغرافيا التقليدية في كفاءة الفصل. وهناك عدة أنواع من الرحلان الكهربائي النطاقي بحسب الأنواع المختلفة من الدواعم المستعملة، وتتضمن هلامات النشاء وهلامات بولي الأكريل أميد ورغوة البولي يوريتان والورق.
وتعد تقنية الرحلان الكهربائي على هلامات النشاء من التقنيات المألوفة على الرغم من الاستعاضة عنها في الوقت الحاضر بهلامات بولي الأكريل أميد، التي تخفض من تأثيرات الانتشار والحمل إلى حدودها الدنيا. تحضَّر صفيحة أو كتلة من هلامة النشاء، ثم تطبق العينة على شكل شريط ضيق بعرض الصفيحة حوالي منتصف المسافة بين طرفيها اللذين يوصلان بمسريين في جسر الوصل. وعندما يمر التيار عبر الخلية تتحرك مكونات المزيج المختلفة بسرعات تتوقف على شحنتها الكهربائية وحجومها وأشكالها. وبتقدُّم الرحلان تهاجر المكوِّنات المشحونة سلباً نحو الأنود والمشحونة إيجاباً نحو الكاتود، ونحصل بالنتيجة على سلسلة من العصابات المفصولة أو على خطوط من مكوّنات العينة التي يمكن إظهارها بملوِّن.
 |
|
| الشكل (2) جهاز الرحلان الكهربائي الشعري النطاق | |
يوضح الشكل (2) جهاز الرحلان الكهربائي الشعري النطاق. يأخذ وسط الفصل شكل أنبوب شعري من السيليكا المصهورة (بقطر داخلي من 10 إلى 100 ميكرو متر وطول 1م ) يحوي كهرليتاً مناسباً. وبعد أن يدخل حجم صغير من العينة في إحدى نهايتيه، يوضع طرفا الأنبوب الشعري في محلول كهرليتي موق (هو عادة المحلول نفسه الموجود في الأنبوب الشعري). يوصل المسريان بعد غمسهما في المحلول بمنبع تيار مستمر قادر على تمرير تيار يصل حتى 250 ميكرو أمبير، ويؤمن فروق كمون تراوح بين 1000 و30000 فولط. يتدفق المحلول عبر مكشاف فوق بنفسجي UV امتصاصي يوضع على إحدى نهايتي الأنبوب الشعري أو قريباً منها تهاجر الجزيئات المعتدلة معاً بالتناضح العكسي. فإذا ضمن الطور المتحرك منظفات تشكل مُذْيَلات micelle، فإن الجزيئات تتآثر بصورة متفاوتة مع هذه المُذْيَلات، فتفتقر عن بعضها بعضاً، كما تمنع امتزاز البروتينات مثلاً على الجدران. تدعى هذه التقنية عندئذ الكروماتوغرافيا الشعرية الإلكتروحركية المذيلة (MECC) micellar electrokinetic capillary chromatography.
تطبيقات الرحلان الكهربائي
تستخدم تقانة الرحلان الكهربائي على نطاق واسع في الطب. فمثلاً يظهر فصل بروتينات المصورة بالرحلان الكهربائي على هلامة النشاء وجود 18 مركباً. ويمكن استخدام مقياس الكثافة لقياس شدة النطاقات الملونة والحصول بذلك على معلومات كمية.
يمثل الشكل (3) تحليل مكونات المصل (ألبومين albumine وغلوبولين globuline)، في حين يمثل الشكل (4) استخدام تقنية الرحلان الكهربائي في التحاليل الأنزيمية التي تلعب دوراً مهماً في التشخيص المرضي.
 |
 |
| الشكل (3) تحليل مكونات المصل | الشكل (4) منحنيات المكشاف الضوئي فوق البنفسجي |