تويت
ليغاز Ligase - Ligase
الليغاز
الليغاز ligase أنزيم مهم موجود في جميع الكائنات الحية، يتوسط وصل جزيئين معاً بتكوين رابطة فسفو دي إسترية بين 5’ فسفات الموجودة في نوَويدة (نوكليوتيدة) nucleotide طاق الدنا DNA وزمرة3’ الهدروكسيل الموجود على نوَويدة أخرى على الطاق المقابل، ومن ثم يلحم الكسور في هيكل الفسفات والسكر في الدنا والرنا.
هناك نوعان من الليغاز: يستخدِم الأول منهما ثنائي نيكوتيناميد النوويد nucleotide binicotinamide (NAD+) تميماً cofactor، ويوجد وحسب عند الجراثيم (البكتريا)، أما النوع الثاني فيستعمل ثالث فسفات الأدينوزين adenosine triphosphate (ATP) تميماً، ويوجد عند حقيقيات النواة eukaryotes والحمات viruses وعاثيات الجراثيم bacteriophages. وتمتلك خلايا الثدييات أربعة نماذج من ليغاز الدنا، جميعها تُنفذ ثلاث وظائف رئيسة، هي: وصل شُدَف أوكازاكي Okazaki fragments في أثناء عملية التنسُّخ replication، وإصلاح الدنا DNA repair ووصل شُدف الصبغيات الناتجة من التأشب (التأشيب) recombination. تختلف أحجام أنزيمات الليغاز فيما بينها، فمثلاً يبلغ حجم أصغر ليغاز معتمد على ثالث فسفات الأدينوزين في عاثية الجراثيم T7 bacteriophage 41 كيلو دالتون، في حين أن حجم الليغاز البشري (I) يزيد على 100 كيلو دالتون.
الشكل (1)
تعمل الليغازات وفق ثلاث مراحل (الشكل 1):
1- تُشكل السلسلة الجانبية من الليزين 34 lysineرابطة مع ثالث فسفات الأدينوزين، ويطرح الأخير اثنتين من مجموعاته الفسفاتية لتكوين معقد من الأدينوزين أحادي الفسفاتAMP adenosine monophosphate والليغاز.
2- تشكل مجموعة الفسفات من هذا المعقد رابطةً مع الفسفات 5’ من طاق الدنا المتصدع، وهذا يُنشط مجموعة الفسفات تمهيداً للمرحلة الثالثة.
3- اتحاد 3’ هدروكسيل الطاق الآخر للدنا مع الفسفات 3’، فتتشكل رابطة جديدة ، وتتحرر مجموعة الـ AMP.
يُشتق الليغاز الأكثر استعمالاً من عاثية الجراثيم T4، وتتطلب الفعالية التحفيزية للأنزيم توافر ATP وأيونات مغنزيوم Mg++. إن حاجة الدنا إلى ثمالات الفسفات المطلوبة يجعلها قادرة على الربط بالفسفرة بوساطة الكيناز عديد النوويد. يحفز الأنزيم كذلك تفاعلات إضافة للفسفات بين البيروفسفات والـ ATP. ويمكن تلخيص تفاعلات الربط التي يقوم بها ليغاز الدنا T4 الموجود عند عاثية الجراثيم T4 على النحو الآتي (الشكل 2):
يتكون ليغاز عاثية الجراثيم T4 من ببتيد متعدد وحيد وزنه الجزيئي 68 كيلو دالتون، يعمل بنشاط أعظمي في درجة باها (pH) تراوح بين 7.5 - 8.0 في حين يفقد نحو 60% من نشاطه عند pH = 6.9 ونحو 35% منه عند pH = 8.3، وإن احتواء الوسط على شوارد Mg++ ضروري، وأفضل تركيز لها هو 10 ممول (mM)، كما أن الكواشف السلفيدريلية sulfhydryl reagents (2- مركابتوإيتانول 2-mercaptoethanol) ضرورية أيضاً. وتثبط المحاليل التي يزيد تركيز كلور الصوديوم فيها عن 200 ممول نشاط الليغاز.
الشكل (2)
درجة حرارة التفاعل ومدته أمران مهمان، وإن الحرارة المثلى لحضن ليغاز الدنا T4 هي 16 ْم، وهي الحرارة المطلوبة لإجراء عمليات ربط عالية الفعالية. ومع ذلك فالليغاز فعال في مجال واسع من درجات الحرارة. ويرتبط نجاح التفاعلات الروتينية، مثل عملية الاستنساخ cloning بكل من درجة الحرارة ومدة الحضن، وكثيراً ما يُحضن ليغاز الدنا في درجة حرارة قدرها 4ْم في ليلة كاملة، أو في درجة حرارة الغرفة مدة تراوح بين 30 و120 دقيقة.
تطبيقات الليغاز
يُستعمل ليغاز دنا العاثية T4 أساساً في ربط جزيئات الدنا مع نهايات متماسكة ملائمة، أو في ربط النهايات الكليلة blunt ended لطاق دنا مع طاق آخر أو مع قطع واصلة صنعية، والتفاعل الأخير هو الأقل سرعة. ويمكن تسريع هذه العملية بإضافة 150- 200 ممول من كلور الصوديوم مع تراكيز منخفضة من البولي إيتيلين غليكول polyethylene glycol (PEG). تعدّ النهاية ’5 فسفات ضرورية لعملية الربط، ولابد من فسفرة الدنا الفاقد لهذه النهاية قبل عملية الربط. تُجرى عملية ربط شُدَف الدنا مع النهاية 5’المتشكلة بحشو جزئي partial filling للنهاية 3’ بسلسلة تفاعلات مراقبة تستعمل شدف كلينو Klenow من بوليمراز I من الأشريكية القولونية E. coli.
محمد ماهر القطيني
الليغاز
الليغاز ligase أنزيم مهم موجود في جميع الكائنات الحية، يتوسط وصل جزيئين معاً بتكوين رابطة فسفو دي إسترية بين 5’ فسفات الموجودة في نوَويدة (نوكليوتيدة) nucleotide طاق الدنا DNA وزمرة3’ الهدروكسيل الموجود على نوَويدة أخرى على الطاق المقابل، ومن ثم يلحم الكسور في هيكل الفسفات والسكر في الدنا والرنا.
هناك نوعان من الليغاز: يستخدِم الأول منهما ثنائي نيكوتيناميد النوويد nucleotide binicotinamide (NAD+) تميماً cofactor، ويوجد وحسب عند الجراثيم (البكتريا)، أما النوع الثاني فيستعمل ثالث فسفات الأدينوزين adenosine triphosphate (ATP) تميماً، ويوجد عند حقيقيات النواة eukaryotes والحمات viruses وعاثيات الجراثيم bacteriophages. وتمتلك خلايا الثدييات أربعة نماذج من ليغاز الدنا، جميعها تُنفذ ثلاث وظائف رئيسة، هي: وصل شُدَف أوكازاكي Okazaki fragments في أثناء عملية التنسُّخ replication، وإصلاح الدنا DNA repair ووصل شُدف الصبغيات الناتجة من التأشب (التأشيب) recombination. تختلف أحجام أنزيمات الليغاز فيما بينها، فمثلاً يبلغ حجم أصغر ليغاز معتمد على ثالث فسفات الأدينوزين في عاثية الجراثيم T7 bacteriophage 41 كيلو دالتون، في حين أن حجم الليغاز البشري (I) يزيد على 100 كيلو دالتون.
الشكل (1)
تعمل الليغازات وفق ثلاث مراحل (الشكل 1):
1- تُشكل السلسلة الجانبية من الليزين 34 lysineرابطة مع ثالث فسفات الأدينوزين، ويطرح الأخير اثنتين من مجموعاته الفسفاتية لتكوين معقد من الأدينوزين أحادي الفسفاتAMP adenosine monophosphate والليغاز.
2- تشكل مجموعة الفسفات من هذا المعقد رابطةً مع الفسفات 5’ من طاق الدنا المتصدع، وهذا يُنشط مجموعة الفسفات تمهيداً للمرحلة الثالثة.
3- اتحاد 3’ هدروكسيل الطاق الآخر للدنا مع الفسفات 3’، فتتشكل رابطة جديدة ، وتتحرر مجموعة الـ AMP.
يُشتق الليغاز الأكثر استعمالاً من عاثية الجراثيم T4، وتتطلب الفعالية التحفيزية للأنزيم توافر ATP وأيونات مغنزيوم Mg++. إن حاجة الدنا إلى ثمالات الفسفات المطلوبة يجعلها قادرة على الربط بالفسفرة بوساطة الكيناز عديد النوويد. يحفز الأنزيم كذلك تفاعلات إضافة للفسفات بين البيروفسفات والـ ATP. ويمكن تلخيص تفاعلات الربط التي يقوم بها ليغاز الدنا T4 الموجود عند عاثية الجراثيم T4 على النحو الآتي (الشكل 2):
يتكون ليغاز عاثية الجراثيم T4 من ببتيد متعدد وحيد وزنه الجزيئي 68 كيلو دالتون، يعمل بنشاط أعظمي في درجة باها (pH) تراوح بين 7.5 - 8.0 في حين يفقد نحو 60% من نشاطه عند pH = 6.9 ونحو 35% منه عند pH = 8.3، وإن احتواء الوسط على شوارد Mg++ ضروري، وأفضل تركيز لها هو 10 ممول (mM)، كما أن الكواشف السلفيدريلية sulfhydryl reagents (2- مركابتوإيتانول 2-mercaptoethanol) ضرورية أيضاً. وتثبط المحاليل التي يزيد تركيز كلور الصوديوم فيها عن 200 ممول نشاط الليغاز.
الشكل (2)
درجة حرارة التفاعل ومدته أمران مهمان، وإن الحرارة المثلى لحضن ليغاز الدنا T4 هي 16 ْم، وهي الحرارة المطلوبة لإجراء عمليات ربط عالية الفعالية. ومع ذلك فالليغاز فعال في مجال واسع من درجات الحرارة. ويرتبط نجاح التفاعلات الروتينية، مثل عملية الاستنساخ cloning بكل من درجة الحرارة ومدة الحضن، وكثيراً ما يُحضن ليغاز الدنا في درجة حرارة قدرها 4ْم في ليلة كاملة، أو في درجة حرارة الغرفة مدة تراوح بين 30 و120 دقيقة.
تطبيقات الليغاز
يُستعمل ليغاز دنا العاثية T4 أساساً في ربط جزيئات الدنا مع نهايات متماسكة ملائمة، أو في ربط النهايات الكليلة blunt ended لطاق دنا مع طاق آخر أو مع قطع واصلة صنعية، والتفاعل الأخير هو الأقل سرعة. ويمكن تسريع هذه العملية بإضافة 150- 200 ممول من كلور الصوديوم مع تراكيز منخفضة من البولي إيتيلين غليكول polyethylene glycol (PEG). تعدّ النهاية ’5 فسفات ضرورية لعملية الربط، ولابد من فسفرة الدنا الفاقد لهذه النهاية قبل عملية الربط. تُجرى عملية ربط شُدَف الدنا مع النهاية 5’المتشكلة بحشو جزئي partial filling للنهاية 3’ بسلسلة تفاعلات مراقبة تستعمل شدف كلينو Klenow من بوليمراز I من الأشريكية القولونية E. coli.
محمد ماهر القطيني